Fatores determinantes do sucesso de programa de transferência de embriões

Embryo
transfer (ET) is a reproductive technology developed at the end of the
nineteenth century and improved during the twentieth century. In this
period, the knowledge advancement of production, handling, storage and
embryo transfer processes made the national and international trade of
bovine embryos possible. Currently, the success rate of ET programs
depends on the effective control of these variables. The negligence in
handling those variables may seriously compromise the results. This
paper briefly describes and discusses the implications of each
variable, which may influence the success of an ET program.

INTRODUÇÃO

A
transferência de embriões (TE) pode ser definida como o processo de
remover um ou mais embriões do trato reprodutivo de uma fêmea doadora e
transferi-los a uma ou mais fêmeas receptoras. Os embriões também podem
ser produzidos no laboratório utilizando técnicas de fecundação in
vitro ou por clonagem de células embrionárias ou somáticas. Entretanto,
considerando que a transferência de um embrião é somente uma de uma
série de etapas destinadas à obtenção de uma gestação por essa via, o
termo TE, no sentido mais amplo, considera também os processos de
superovulação e inseminação das doadoras, coleta de embriões,
isolamento, avaliação e cultura dos embriões durante um curto período,
micromanipulação (com finalidade de sexagem ou genotipagem),
congelamento e transferência dos embriões.

Desde o nascimento
dos primeiros produtos oriundos dessa tecnologia (Heape, 1890), a TE
foi utilizada como ferramenta auxiliar nas pesquisas com reprodução
animal, sendo que sua aplicação comercial ocorreu somente a partir da
década de 1980. Atualmente, a industria da TE é um negócio de escala
internacional. Para os interessados em conhecer um pouco mais a
história do desenvolvimento da tecnologia da TE recomenda-se a leitura
da excelente revisão sobre esse tópico feita recentemente por
Betteridge (2003 ).

Superovulação

Nos
últimos 25 anos, foram poucos os avanços conseguidos para melhorar a
resposta aos tratamentos de superovulação. Isso pode ser mostrado da
análise do número médio de embriões recuperados de vacas superovuladas
em uma central norte-americana de TE (Em Tran Inc.). Em 1979, a média
de embriões recuperados era de 4,6 contra 4,8, vinte anos depois
(Hasler, 2003). Esses dados consideram todas as doadoras superovuladas,
independentemente de não terem manifestado cio, ou não terem sido
coletadas devido à falta de resposta ovariana. Com efeito, um sério
problema, ainda sem solução, é que, aproximadamente, 20% das doadoras
não produzem embriões transferíveis (Tabela 1).

Tabela 1. Distribuição das vacas conforme o número de embriões utilizáveis por tratamento (Silva et al., 2008).

No de embriões - 0 - Menos que 3 - 3 a 6 - Mais que 6
% vacas 20% - 10% - 45% - 25%

Embora
a produção média de embriões por doadora não tenha sido aumentada
significativamente, houve um avanço considerável na flexibilidade para
a aplicação dos tratamentos. Essa melhora foi possível graças ao uso de
dispositivos liberadores de progesterona aplicados por via vaginal ou
subcutânea (Bo et al., 2006). Atualmente, a superovulação pode ser
iniciada após a inserção de um dispositivo liberador de progesterona em
qualquer momento do ciclo estral. Por outro lado, tem sido claramente
demonstrado que não existe qualquer beneficio do intervalo de espera da
manifestação de dois cios consecutivos entre superovulações, como
inicialmente acreditado. As doadoras podem ser superovuladas
repetidamente cada 40 dias, durante um período de 1 a 2 anos, com
resultados satisfatórios (Hasler, 2003)

Recuperação de embriões

Após
a ampla aceitação da recuperação não cirúrgica de embriões desde os
anos 80s, os procedimentos para recuperar embriões têm recebido pouca
atenção. Praticamente, todos os técnicos de TE utilizam um cateter tipo
Foley, com um "balão" inflável na extremidade para fixar o cateter no
útero. Tradicionalmente, as sondas de Foley eram compostas de borracha
ou látex. Recentemente, o silicone foi utilizado para substituir esses
materiais na confecção das sondas específicas para bovinos. Essas
sondas apresentam várias vantagens, incluindo a capacidade de suportar
a esterilização em autoclave, manutenção da forma concêntrica do balão,
bem como múltiplas saídas de drenagem.

A maior parte dos
técnicos opta por utilizar um grande volume de líquido (um ou dois
litros de PBS), sendo que a metade é introduzida por fluxo de gravidade
em cada corno uterino, embora exista uma crescente opinião que o PBS
pode ser liberado no corpo do útero de forma a realizar a "lavagem"
simultânea dos dois cornos uterinos. Nesse caso, o balão é inflado logo
depois de passar a cervix. A eficiência da coleta parece ser semelhante
nos dois procedimentos. Uma prática interessante após a coleta consiste
em encher os cornos uterinos com PBS, bloquear a saída da sonda e
soltar o animal no curral enquanto é realizada a procura dos embriões.
Caso não sejam encontrados embriões (ou encontrado um número muito
inferior ao número de corpos lúteos), os animais serão novamente
coletados. Com essa prática, alguns técnicos tem aumentado em
aproximadamente 2 a 3 o número médio de embriões recuperados (Netto et
al., 2005)

Avaliação e manipulação de embriões

No
início, a indústria comercial de TE utilizava o mesmo meio (PBS
suplementado com soro) para realizar a coleta e a conservação dos
embriões. Atualmente, várias empresas oferecem meios mais complexos,
elaborados especificamente para atender as diversas etapas da TE.
Embora esses produtos ofereçam uma maior "segurança psicológica" ao
técnico, não existe evidência científica convincente demonstrando que o
uso desses produtos resulte em uma melhora significativa da qualidade
após a coleta ou das taxas de prenhez.

Atualmente, a avaliação
dos embriões é relativamente bem padronizada, tanto para o estágio de
desenvolvimento, como para a qualidade embrionária. As definições
desses dois conceitos estão disponíveis no Manual editado pela
Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (IETS). Apesar de
existir vários procedimentos (metabólicos, capacidade de
desenvolvimento em cultura, etc) para estimar a viabilidade dos
embriões, atualmente só a avaliação morfológica (utilizando microscopia
ótica) é utilizada para avaliar a qualidade dos embriões. Existe uma
boa correlação entre a qualidade morfológica dos embriões e a posterior
taxa de prenhez (Alvarez et al., 2007).

Transferência de embriões

Assumindo-se
uma boa competência do técnico que executa a TE, os principais fatores
que afetam a taxa de prenhez são a qualidade do embrião e da receptora.
Em muitas operações comerciais, a taxa de sucesso com TE freqüentemente
excede 70%. Porém, o planejamento de um programa de TE deve considerar
cifras mais modestas (da ordem de 50%), mesmo quando em determinadas
ocasiões sejam alcançadas taxas de prenhez da ordem de 80% após a
transferência de embriões frescos de boa qualidade em receptoras
idôneas (Hasler, 2003).

A qualidade do embrião é sabidamente um
fator de grande relevância na taxa de prenhez. Contudo, os técnicos que
trabalham nas fazendas (ou mesmo nas centrais de TE) têm pouca escolha
com relação a esta variável no momento de realizar a transferência. Por
outro lado, a condição da receptora pode influenciar as taxas de
prenhez. Em raças européias, o uso de vacas e novilhas de corte e
novilhas leiteiras resulta em taxas de prenhez semelhantes, enquanto
que vacas leiteiras apresentam uma taxa de prenhez consideravelmente
menor.

Há muito tempo é conhecido que o grau de sincronização
do cio entre o embrião e a receptora influencia a taxa de prenhez.
Vários estudos parecem indicar que a sincronia é mais crítica em
receptoras de corte que de leite. Entretanto, quando receptoras de
corte e leiteiras foram comparadas no mesmo estudo (Hasler, 2001) não
houve diferença nas exigências de sincronia. Também, parece que uma
assincronia de 24 horas, para mais ou para menos, entre doadora e
receptora, não compromete a taxa de prenhez quando são transferidos
embriões frescos ou congelados.

Diversos estudos direcionados a
melhorar as taxas de prenhez das receptoras utilizando hormônios
(progesterona, hCG, bSTr, GnRH) ou outras drogas (banamine,
clenbuterol) não apresentaram resultados consistentes.

Congelamento de embriões

A
conservação de embriões bovinos congelados é um procedimento
comercialmente viável desde os anos 80s, resultado das pesquisas
pioneiras realizadas na Universidade de Cambridge (Polge e Willadsen,
1978). Inicialmente, o glicerol foi a principal substância utilizada
como crioprotetor das células embrionárias. O inconveniente dessa
tecnologia era a necessidade de descongelar as palhetas e realizar a
avaliação morfológica antes de realizar a transferência. Para tanto
era necessário dispor de um microscópio, um meio especifico de
descongelamento e um embriologista treinado para fazer a avaliação do
embrião no momento da descongelação.

O uso do etileno glicol
como um crioprotetor, no lugar do glicerol fez possível a transferência
do embrião diretamente no útero da receptora, sem necessidade de
retirar o embrião da palheta em que foi congelado. Essa inovação
representou uma melhora significativa no campo da TE nos anos 90s. Como
as taxas de prenhez são semelhantes entre os embriões congelados com
glicerol e etileno glicol, atualmente o etileno glicol é o crioprotetor
predominante na maior parte dos programas comerciais de TE. As taxas de
prenhez que resultam da transferência de embriões congelados e
descongelados são atualmente, aproximadamente, 10% menores que as
obtidas com embriões frescos de qualidade semelhante.

FIV

O
termo FIV (Fecundação in vitro) envolve a produção de embriões
produzidos in vitro e inclui as etapas de maturação, fecundação e
cultura in vitro, até o estágio de mórula ou (mais freqüentemente)
blastocisto. A padronização laboratorial das condições ambientais
(temperatura, umidade, etc) para realizar a FIV, fez com que no inicio
dos anos 90s, várias empresas, que atuavam no ramo da TE, começassem a
oferecer programas de FIV em base comercial.

A produção
comercial de embriões FIV rapidamente alcançou um grande sucesso e como
resultado milhares de prenhezes foram estabelecidas. Infelizmente, um
número significativo de gestações foi caracterizado por aborto,
dificuldades ao parto, morte perinatal ou anomalias dos bezerros
(Smith, 2007). Devido a esses problemas, a demanda pelos serviços de
FIV nos EUA declinou significativamente. Nos últimos anos, contudo,
esses problemas têm sido reduzidos pelo uso de sistemas de cultura com
meios semidefinidos em substituição ao soro fetal e/ou co-cultura.
Atualmente, Brasil é o maior usuário mundial da tecnologia de FIV,
sendo que o número de transferências utilizando embriões produzidos por
FIV ou recuperados de vacas superovuladas é muito próximo. Acredita-se
que, no futuro, o procedimento da FIV para a produção de embriões
deverá substituir a TE tradicional, envolvendo superovulação e coleta
uterina dos embriões.

Micro-manipulação de embriões

Os
primeiros bezerros clones nascidos originaram-se da divisão de embriões
em duas metades (Ozil et al., 1982). Esta técnica deve ser realizada
com auxílio de um micromanipulador (manualmente também é possível, mas
requer uma boa habilidade e experiência prévia do operador na
manipulação de embriões). A bipartição possibilita um aumento no número
de bezerros produzidos de um determinado grupo de embriões e também a
produção de gêmeos idênticos, oriundos de alguns desses embriões.
Entretanto, esta tecnologia atualmente é menos utilizada que durante os
anos 80s, período em que a técnica ficou disponível.

Outro uso
da manipulação envolve a remoção de algumas células dos embriões com o
uso do micromanipulador e posterior análise de PCR para determinar o
sexo ou a presença de determinados genótipos. Esta tecnologia, além de
habilidade técnica do operador, precisa de equipamentos relativamente
caros e sofisticados, razão pela qual não tem sido amplamente adotada
pela indústria comercial de TE.

A clonagem de bovinos adultos
pela transferência do núcleo de células somáticas é uma área que
atualmente vem recebendo grande atenção na imprensa e em laboratórios
de pesquisa acadêmica. A comercialização de bovinos originados por essa
tecnologia ainda é bastante limitada. No Brasil, o comércio de clones é
limitado ao mercado especulativo de animais de excepcional valor
comercial (vide caso do famoso touro "Bandido", utilizado em rodeios),
bem como atender a demanda na preservação de raças nativas ou
adaptadas, em vias de extinção.

Sanidade e Bio-segurança

Como
o comércio internacional de embriões congelados entre países cresceu
rapidamente nos anos 80s, atenção considerável foi dada ao estudo das
eventuais doenças transmitidas pelo embrião quando transferido fresco
ou congelado. Como resultado, atualmente devem ser respeitados
procedimentos específicos de produção e manipulação dos embriões
destinados ao movimento entre países (Stringfellow et al., 2004). Esses
protocolos têm provado ser bastante eficientes e não existe notícia de
qualquer problema sanitário relacionado com a transmissão de doenças
pelo embrião transportado internacionalmente. Entretanto, os protocolos
existentes aplicam-se a embriões produzidos in vivo, de forma que mais
pesquisas são necessárias para desenvolver regulamentos sanitários mais
específicos para o comercio internacional de embriões produzidos in
vitro, clones e embriões transgênicos. Devidos aos recentes eventos
internacionais de aparecimento de doenças de importância econômica
(febre aftosa) e/ou que afetam à saúde humana (BSE), é altamente
provável que o uso de meios de cultura sem a presença de produtos de
origem animal será obrigatória para a manipulação e congelamento de
embriões bovinos.

Rafael Herrera Alvarez
Centro de P&D Genética e Reprodução Animal, Instituto de Zootecnia-APTA, Nova Odessa-SP, 13460-000, Brasil.
Contatos: herrera@iz.sp.gov.br.

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